Адрес этой статьи в интернете: www.biophys.ru/archive/congress2012/proc-p79.htm
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Россельхозакадемии
190103, Россия, Санкт-Петербург-Пушкин, Московское шоссе 55-а, E-mail: prof.kouzmina@mail.ru
Возможность использования в экспериментах яичников убитых животных, в качестве источника получения женских гамет, для выявления эффектов различных биологически активных веществ на мейоз ооцитов, их оплодотворение и развитие эмбрионов, позволяет идентифицировать механизмы реализации этих эффектов на репродуктивную функцию. Нитрозометилмочевина (НММ )– супермутаген, относится к группе биологически активных соединений. Имеется ряд данных о применении его и других супермутагенов в животноводстве и медицине. Действуя в исключительно малых дозах, супермутагены оказывают различное влияние на рост и развитие овец, кроликов и т.д. [1].
В наших исследованиях предпринята попытка выявления эффектов НММ на созревание ооцитов коров in vitro. В этом случае открывается возможность воздействия супермутагеном непосредственно на женскую гамету. В экспериментах использовали донорские ооциты коров, убитых на мясокомбинате. Селекцию клеток, их культивирование, оплодотворение ооцитов проводили в соответствии с методами, разработанными в лаборатории биологии развития ГНУ ВНИИГРЖ [2]. Базовой средой для культивирования служила ТС-199, дополненная 15% фетальной бычьей сыворотки, 106клеток гранулезы на мл среды, в опытную добавляли НММ в концентрации 10-8г/л. Статус хроматина ооцитов и эмбрионов оценивали по методу Тарковского [3]. Для сравнения результатов, полученных в опытных и контрольных группах, использовали критерии ч2 с помощью статистической программы Sigma Stat. Достоверность различия сравниваемых средних значений оценивали при трех уровнях значимости: P<0,05; P<0,01; P<0,001. Хроматин ооцитов анализировали через 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 часов.
Всего прокультивировано 568 ооцитов на разных стадиях мейоза (диплотена, диакинез, метафаза-I, анафаза, телофаза, метафаза-II). Установлен диапазон концентраций, в котором данный препарат оказывает положительное действие на процесс прохождения мейоза (10-10, 10-8, 10-6г/л), которое выражалось в синхронизации ядерного созревания популяции донорских ооцитов, снижении уровня дегенераций хроматина в опытных группах по сравнению с контрольной, увеличении числа дробящихся зародышей после оплодотворения in vitro ооцитов. Более 90% ооцитов, выделяемых из антральных фолликулов коров диаметром 3-6 мм для культивирования, находятся на стадии диплотены. Цитогенетический анализ ооцитов, прокультивированных с НММ (концентрация 10-8), показал, что в определенные сроки подавляющее большинство клеток синхронно созревали до определенной стадии мейоза. К 10 часам экспозиции 89% ооцитов опытной группы находилось на стадии диакинеза. В это же время в контрольной группе 64% ооцитов оставались на стадии диплотены. Через 15 часов культивирования 91% ооцитов опытной группы достигали стадии метафазы –I. При увеличении срока экспозиции до 20 часов 100% ооцитов реинициировали мейоз, 79% из них находились на стадии телофазы. 98% клеток завершали созревание к 30 часам. Т.о. при культивировании ооцитов с НММ стадия диакинеза длилась 5 часов, 15 часов культивирования необходимо ооцитам для достижения стадии метафазы –I. Срок достижения ооцитами, находящимися на стадии метафазы –I, метафазы –II составил 10 часов. Значительный рост числа клеток с выраженными хромосомными аномалиями в опытной группе через 35-40 часов культивирования также объясним, если учесть одновременное созревание большого числа ооцитов, которое влечет за собой дегенерацию хроматина в результате их перезревания. При оплодотворении через 25 часов ооцитов, созревших in vitro в среде с НММ, выход эмбрионов на стадиях поздней морулы, бластоцисты в опытной группе составил 29% , против 18% в контроле (Р<0.05). При морфологическом анализе не обнаружено достоверных различия между эмбрионами опытной и контрольной групп, в т.ч. по уровню бластомеров с пикнотическими ядрами, набору хромосом в бластомерах и т.д.
Полученные данные свидетельствуют о стимулирующем влиянии сверхнизких концентраций НММ на созревание ооцитов коров in vitro и возможности получения из них доимплантационных эмбрионов.
STIMULATING EFFECT OF ULTRALOW CONCENTRATION OF NITROSOMETHYLUREA ON MATURING OF BOVINE OOCYTES IN VITRO
T.I.Kuzmina, D.A.Novichkova
All-Russian Research Institute for Farm Animal Genetics & Breeding, E-mail: prof.kouzmina@mail.ru
Литература