Адрес этой статьи в интернете: www.biophys.ru/archive/congress2012/proc-p54-d.htm

 

ДЕЙСТВИЕ СЛАБЫХ ПОСТОЯННЫХ И НИЗКОЧАСТОТНЫХ ПЕРЕМЕННЫХ МАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ НА АКТИВНОСТЬ ПЕРОКСИДАЗЫ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ

 

Яблокова Е.В., Новиков В.В., Кувичкин В.В., Фесенко Е.Е.

Учреждение Российской академии наук Институт биофизики клетки РАН, 142290, Россия, МО, г. Пущино, ул. Институтская 3, E-mail: docmag@mail.ru

 

Аннотация: В экспериментах использовали воду высокой степени очистки (имеющую высокое удельное сопротивление 18 МОм/см). Раствор фермента подвергали воздействию коллинеарных слабых магнитных полей (МП) - постоянного (42 µТ ) и переменного (0.1 µТ, частота - 4.4 Гц). Время инкубации растворов составляло от 30 мин до 4 часов. Далее к раствору фермента добавляли о-фенилендиамин и Н2О2, реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин. Показано, что воздействие слабыми комбинированными МП влияет на скорость реакции окисления о-фенилендиамина перекисью водорода, где катализатором является фермент пероксидаза хрена. Происходит снижение активности пероксидазы хрена в реакции после обработки растворов фермента МП, по сравнению с контрольными образцами. Вероятно, что снижение активности пероксидазы хрена при действии слабых МП связано с конформационными изменениями структуры этого белка, т.к. спектры его флуоресценции (собственной и в присутствии флуоресцентных зондов) до и после такого воздействия отличаются.

 

Ключевые слова: слабое магнитное поле, пероксидаза, водные растворы

 

Широкомасштабные исследования действия магнитных полей (МП) на биологические объекты, проведенные, в частности в Институте биофизики клетки РАН, привели к открытию различных биологических эффектов МП на уровне организма, клеточном и молекулярном уровнях. Одним из наиболее значимых и перспективных является эффект активации процессов распада белков и пептидов в физико-химических и биологических системах при действии слабых магнитных полей [1]. Этот результат является приоритетным, не имеющим аналогов в мире, и может служить основой для создания новых подходов к профилактике и лечению онкологических и нейродегенеративных заболеваний, связанных с отложением патологических белков в тканях организма. При анализе полученных результатов обращает на себя внимание тот факт, что величины максимальной биологической активности, обнаруженные в опытах при настройке поля в различных частотных диапазонах (диапазон циклотронных частот ионов аминокислот, диапазоны частот неорганических ионов - кальция и калия), а также в пределах одного и того же частотного диапазона практически совпадают или близки [2,3]. Это обстоятельство свидетельствует в пользу универсальности эффекторной части механизма, приводящего к повреждению опухолей и нейрофибриллярных структур при действии слабых магнитных полей. Ранее нами сообщалось о том, что при действии слабого МП на целый организм активируется система противоопухолевого иммунитета, в частности происходит стимуляция продукции фактора некроза опухолей (ФНО) макрофагами брюшной полости у мышей [4]. Этот опосредованный через иммунную систему механизм, по-видимому, вряд ли является единственным, и не может объяснить целый ряд обнаруженных нами экспериментальных фактов. Во-первых, опыты на мышах различных линий (SHK, CBA, C57Bl, Balb) показали близкие величины противоопухолевой активности слабого МП. Во-вторых, при использовании слабых ЭМП сантиметрового диапазона отмечена приблизительно такая же активация продукции ФНО [4], однако выраженность противоопухолевого эффекта в этом случае ниже. По нашему мнению, возможными кандидатами на роль повреждающих агентов для опухолевых клеток в случае воздействия слабыми МП могут являться активные формы кислорода (АФК) продуцирующиеся и действующие непосредственно в опухолевой ткани и/или в клетках иммунной системы. Известно, что в опухолевой ткани происходят преимущественно анаэробные процессы, система эндогенных антиоксидантов недостаточна активна. В этих условиях даже незначительные локальные повышения концентраций АФК могут привести к избирательному повреждению клеток опухолей, в отличие от клеток нормальной ткани. Все эти эффекты могут быть обусловлены действием АФК, в частности перекисей. В этой связи заманчиво предположить, что сложные магнитные сигналы, настроенные на резонанс ионов и компонентов среды, могут при воздействии на организм приводить к локальному повышению концентраций АФК, и осуществлять в связи с этим биологические эффекты.

В связи с появлением в последнее время ряда убедительных экспериментальных и теоретических исследований, показывающий вероятность участие АФК в реализации биологических эффектов слабых МП [1,5], изучение влияния слабых МП на ферментативные системы генерации и деградации активных форм кислорода особенно актуально.

Мы исследовали активность пероксидазы хрена (Sigma) при действии слабых комбинированных МП, используя в качестве субстрата орто-фенилендиамин (ОФД). Пероксидаза хрена (HRP) достаточно изучена, поэтому этот фермент - полезная тест система для научных исследований. HRP имеет молекулярную массу около 44,2 кДа, представляет собой гликопротеид и имеет четыре остатка аминокислоты лизина для соединения с молекулой, которую требуется пометить. HRP представляет собой идеальный фермент для многих методик, так как имеет относительно небольшой размер, относительно стабильна и более дешева, чем альтернативы — например, щелочная фосфатаза. HRP имеет большее количество оборотов в единицу времени и потому обеспечивает развитие достаточно сильного сигнала за относительно небольшой период времени. Пероксидаза хрена в свободной форме или в виде конъюгатов с другими молекулами требует наличие субстрата для визуализации. HRP окисляет субстрат в присутствии пероксида водорода, при этом образуются продукты, которые можно детектировать спектрофотометрически.

В экспериментах использовали воду высокой степени очистки (E-pure Module (Barnsted/Termolyne Corporation)), имеющую высокое удельное сопротивление (18 МОм/см). Применялись следующие растворы: 0.005 М NaСl (о.с.ч.), буферные растворы 0.1 М лимонной кислоты - цитрат натрия (pH 5.2), КН2РО4 (рН 6.0), Раствор фермента и других соединений подвергали воздействию коллинеарных слабых МП - постоянного (42 µТ ) и переменного (0.1 µТ, частота - 4.4 Гц). Время инкубации растворов составляло от 30 мин до 4 часов. Далее к раствору фермента добавляли о-фенилендиамин и Н2О2, реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин.

Показано, что воздействие слабыми комбинированными МП влияет на скорость реакции окисления о-фенилендиамина перекисью водорода, где катализатором является фермент пероксидаза хрена. Происходит значимое снижение активности пероксидазы хрена в реакции после обработки растворов фермента МП, по сравнению с контрольными образцами (Рис.1, 2).

Зарегистрированный эффект зависит от ряда физико­химических параметров данной реакции. На изменение активности  фермента в условиях действия слабыми МП влияют солевой состав водной среды, температура и рН. Следует отметить, что максимальные изменения активности фермента, обработанного МП, наблюдаются, когда в качестве реакционной среды используется вода высокой степени очистки (Рис.3).

В буферных средах и в присутствии солей изменение активности пероксидазы хрена, после магнитной обработки, становится значительно более слабым, а во многих случаях, не обнаруживается вовсе. Показано, что действие МП не оказывает заметного влияния на процесс при обработке отдельных компонентов реакционной смеси (за исключением раствора фермента), таких как, например, перекись водорода и растворов ряда солей. Вероятно, что снижение активности пероксидазы хрена при действии слабых МП связано с конформационными изменениями структуры этого белка, т.к. спектры его флуоресценции (собственной и в присутствии флуоресцентных зондов) до и после такого воздействия отличаются.

 

Рис.1.Спектры поглощения реакционной смеси, содержащей 1.23х10-4 М о-фенилендиамина, 1.00х10-4 М Н2О2, 2.08х10-9М пероксидазы до (1) и после (2) обработки слабыми магнитными полями.

Рис.2.Влияние слабых магнитных полей на активность пероксидазы при t=20ºC (1,2), 15ºC (3,4) .

1 – контроль, 2 – опыт; 3 – контроль, 4 – опыт.

Рис.3.Влияние слабых магнитных полей на активность пероксидазы в водно-солевых растворах.

1, 2 – контроль, опыт, вода;

3,4 - контроль, опыт, 0.005 М раствор NaCl,;

5,6 - контроль, опыт, 0.1М буфер лимонная кислота-цитрат, рН=5.2.

 

Таким образом, результаты проведенных экспериментов усиливают гипотезу об участии активных форм кислорода в реализации эффектов слабых МП. Нам удалось найти путем дифференциального экспериментального анализа при обработке полем отдельных компонентов реакционной смеси в системе фермент-субстрат-окислитель основную молекулярную мишень действия слабых комбинированных магнитных полей – фермент пероксидазу.

 

THE EFFECT OF WEAK STATIC AND LOW-FREQUENCY MAGNETIC FIELDS ON THE ACTIVITY OF PEROXIDASE IN AQUEOUS SOLUTIONS

E. V. Yablokova, V. V. Novikov, V. V. Kuvichkin, E. E. Fesenko

Institute of Cell Biophysics of the Russian Academy of Siences, E-mail: docmag@mail.ru

 

Литература

1.      Новиков В.В., Фесенко Е.Е. // Биофизика, 2001, Т. 46, №.2, с. 235.

2.  Novikov V.V., Novikov G.V., Fesenko E.E. // Bioelectromagnetics, 2009, V. 30, N 5, p. 343.

3.  Bobkova N.V., Novikov V.V., Medvinskaya N.I., Aleksandrova I.Y., Nesterova I.V., Fesenko E.E. // Eur. J. Oncol. Library, 2010, V. 5, p. 235.

4.  Новоселова Е.Г., Огай В.Б., Сорокина О.В., Новиков В.В., Фесенко Е.Е. // Биофизика, 2001. Т.46, №1, с. 131.

5.  Пономарев В.О., Новиков В.В. // Биофизика, 2009, Т. 54, №2, с. 235.